Linka 291, jakožto vůbec první městská autobusová linka v Praze, provozovaná autobusy s nižší přepravní kapacitou, poprvé vyjela 18. dubna 2003, přičemž úvodní trasa I. P. Pavlova – Karlovo náměstí – I. P. Pavlova zůstala, pouze s menší obměnou zastávek, zachována do dnešních dnů.

Během roku 2003 se hlavní město Praha účastnilo projektu Trendsetter (Setting Trends for Sustainable Urban Mobility), zaměřeného na zlepšení kvality životního prostředí, s čímž souvisí též zlepšení veřejné dopravy. Součástí projektu bylo prozkoumání možnosti experimentálního zavedení minibusové linky v centrální části města, v oblasti s vysokou docházkovou vzdáleností k jiným druhům veřejné dopravy, přičemž se, jako pro tento účel nejvhodnější, zvolila oblast Karlova.

V oblasti Karlova, která byla do zavedení linky 291 obsluhována veřejnou dopravou pouze 1x denně, se nachází větší množství zdravotnických zařízení, např. dětská nemocnice Karlov, porodnice U Apolináře nebo Všeobecná fakultní nemocnice na Karlově náměstí, jenž přirozeně navštěvují zejména starší osoby a osoby se sníženou pohyblivostí - právě těm přišlo zřízení nové minibusové linky asi nejvíc vhod.

Dalšími stálými klienty linky je kromě pacientů též nemocniční personál, či studenti Přírodovědecké fakulty UK, a tak přestože je linka obsluhována minibusy, není problém narazit na spoj, ve kterém jede třeba 30 cestujících, zejména v ranní špičce. Naopak místní obyvatelé linku příliš nevyužívají, jednak nejede přímo k metru (před zastavením na Karlově náměstí musí projet Resslovou ulicí, což výrazně prodlužuje cestu, na I. P. Pavlova zastavuje až v Sokolské ulici, daleko od vchodu do metra) a dále se ani moc obytné zástavby podél trasy linky nevyskytuje, takže je téměř vždy výhodnější jít k metru pěšky či celou trasu jet tramvají.